吡啶甲酸铬安全性研究进展
最近由于毒胶囊事件，大家谈铬色变。实际上有毒的是六价铬，三价铬还可以用作食品和饲料添加剂。下面的文章介绍了吡啶甲酸铬的安全性。
作者简介：毕晋明，北京华谷生物营养科技发展有限公司，硕士。
张敏红，中国农业科学院研究员，博士生导师，主要从事动物营养方面研究矿物元素是动物营养中的一大类无机营养素。目前已查明的必需微量元素有铁、锌、铜、锰、碘、硒、钴、钼、氟、铬、硼等12种，且必须由外界供给。各元素在供给量上存在一安全范围，添加量不足导致相应元素缺乏症，添加量超过安全范围便导致机体中毒。同时发现，畜禽对微量元素的耐受性也随动物种类而异。猪、禽对铁的耐受量为3000mg/kg、1000mg/kg，对铜的耐受量为250mg/kg、300mg/kg，其他微量元素同样具有类似效应。当微量元素在饲粮中含量较低时为必需矿物元素，在含量过高情况下则可能是有毒有害元素，必需矿物元素和有毒有害元素对动物而言是相对的。
铬元素作为必需微量元素之一，其生理作用日益受到研究者重视。研究表明：铬与糖代谢、脂代谢、蛋白质代谢以及核酸代谢密切相关。同时发现，各种动物对铬的耐受力都较强。可耐受铬的氧化物3000mg/kg，铬的氯化物可耐受1000mg/kg。吡啶甲酸铬作为有机铬制剂，其安全性也日益受到关注。在畜牧生产上，吡啶甲酸铬对缓解环境应激、提高瘦肉率、增强抵抗力均有明显的促进作用，而被广泛应用。但究其使用量而言，虽然一些国家已批准吡啶甲酸铬在畜禽日粮中的添加，但目前尚未正式发布动物最低需要量和最高耐受量数据。研究报道，血浆铬的正常生理浓度为0.1-2.1μg/ml(Cerullietal.,1998)，人类肝中铬的生理浓度为5.4-470ηg/g肝湿重（－0.1-9μM）（Versieck，1985），超量添加（远高于生理剂量）吡啶甲酸铬有可能产生DNA毒性和细胞毒性。为此，本文对吡啶甲酸铬的安全性进行综述，以便为日后吡啶甲酸铬的研究提供理论基础。
1、吡啶甲酸铬理化特性及结构特征
吡啶甲酸铬（Chromiumpicolinate），分子式Cr(C6H4NO2)3，分子量为418.33，紫红色结晶性细小粉末，常温下稳定，微溶于水，不溶于乙醇。整个分子结构呈电中性，且具有疏水特性，因此可以以完整的结构进行跨膜吸收。吡啶甲酸铬的分子结构与GTF部分相似。1977年，Toepfer认为GTF是铬的生物活性形式，其结构为烟酸-铬-烟酸与天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸形成的配合体。吡啶甲酸铬的类GTF结构决定了自身较好的吸收率，并能更有效地发挥自身的生物学功能。据报道，普通铬制剂吸收率为0.5%左右，而吡啶甲酸铬吸收率达2%－5%（Anderson，1996）。
2、吡啶甲酸铬安全性研究
吡啶甲酸铬作为营养添加剂，已经得到广泛的应用。但是从1995年首次报道了吡啶甲酸铬的危害性之后，吡啶甲酸铬的安全性问题就一直成为研究的热点。迄今为止，对吡啶甲酸铬的安全性研究已得到一些数据，但结论不尽相同。
据NTP（NationalToxicologyProgram）报道，不管有无添加小鼠肝脏S9代谢激活物，吡啶甲酸铬对TA1535、TA97、TA98、TA100、TA102、TA104细胞株均未致突变性。在小鼠日粮中添加2500mg/kg.bw的一水吡啶甲酸铬，小鼠骨髓细胞未发现基因断裂效应。Kato等（1998）对十位肥胖女士（每日服用400mg吡啶甲酸铬）观察，八周后尿样中DNA碱基氧化产物5-羟甲基尿嘧啶水平没有发生变化。Anderson等(1997)向小鼠日粮中添加100mg/kg日粮的铬（吡啶甲酸铬形式），饲喂24周也未发现吡啶甲酸铬急性毒性。
针对超量添加吡啶甲酸铬时的细胞毒性和基因毒性也有研究报道。吡啶甲酸铬细胞毒性主要体现在细胞凋亡和线粒体损伤上。Manygoats(2002)研究发现，1mM（125倍适宜量）吡啶甲酸铬添加可导致线粒体损伤和细胞凋亡，可能是由于线粒体呼吸作用受到抑制（主要发生在复合体Ⅰ上），NADH的合成减少，消耗增大所致；线粒体内膜通道的破坏（线粒体的渗透性转换孔—MPT途径），导致线粒体基质成分丧失，线粒体功能和细胞器发生实质性膨胀，接着线粒体外膜破裂，细胞色素C和凋亡诱导因子释放，进而激活核酸内切酶和Caspase，引发细胞凋亡(GreenD等,1998)。
吡啶甲酸铬基因毒性主要表现在DNA碱基氧化、DNA链断裂和基因突变上。Hepburn(2003)研究发现：给小鼠注射吡啶甲酸铬80天后（~600uMCr,75倍适宜量），造成脂质过氧化，并使尿中DNA碱基氧化产物8-oxo-dG含量升高。另有报道提示：在诸如维生素C之类的生物抗氧化剂存在的条件下，吡啶甲酸铬可以断裂DNA双链，使超螺旋DNA松弛。Stohs(1998)等研究发现，50mg/ml（120mM）吡啶甲酸铬处理巨噬细胞J774A.124h后，造成DNA链断裂，细胞中存在DNA碎片。SpeetjensJK(1999)的体外实验研究发现：吡啶甲酸铬可以导致质粒DNA单链断裂。在小鼠淋巴细胞上的毒理试验表明：不管是否添加S9，1.2mM（150倍适宜量）、2.39mM吡啶甲酸铬均显著诱导淋巴细胞基因突变（Whittaker等，2005）。
由此可见，在体内研究吡啶甲酸铬的安全性上，除静脉注射途径外，未见毒性报道。这可能与吡啶甲酸铬的吸收率（2%－5%）以及机体内环境代谢有关；吡啶甲酸铬静脉注射途径的吸收率远高于肠道吸收率。体外细胞培养研究上，多数实验报道，超量添加吡啶甲酸铬（>0.6mM，75倍适宜量）对细胞和DNA产生毒性作用。但也有个别试验报道，高剂量吡啶甲酸铬（>0.6mM）对细胞和DNA不产生毒性作用，这可能与不同细胞株的耐受性不同和吡啶甲酸铬的吸收率降低有关。
3、超量添加吡啶甲酸铬毒性作用的代谢途径
迄今为止，从国内外吡啶甲酸铬安全性研究报道中发现，吡啶甲酸铬毒性作用与其代谢途径密切相关，其代谢途径主要归纳为两条。
3.1吡啶甲酸铬氧化-还原途径
吡啶甲酸铬在胞内还原剂（维生素C，硫醇等）存在的条件下发生类Fenton反应。在此过程中生成大量对DNA稳定性影响的ROS，如超氧离子，过氧离子，羟基自由基，过氧化氢等。ROS的产生，使蛋白质、脂质过氧化生成羰基蛋白、脂质过氧化物等氧化产物，同时使细胞膜通透性、膜流动性降低，细胞脆性升高，细胞完整性遭到破坏。另一方面，ROS产生后降低了Ca2+-ATP酶与钙通道活性，造成Ca超载，从而激活Ca2+-依赖蛋白酶，磷脂酶（PLA2）及核酸内切酶（刘欣等，2001）。PLA2的激活,使膜磷脂降解,磷脂含量降低,导致膜通透性增加,Ca2+易于进入细胞内,使细胞内Ca2+超载，形成恶性循环。核酸内切酶的激活,催化基因组DNA在核小体间降解;Ca2+浓度的升高还可激活谷氨酰胺转化酶和蛋白激酶C等,使细胞骨架断裂,细胞浆蛋白交叉联合,促使凋亡发生（Ui-Tei等，2000）。此外，Ca2+浓度的改变还可激活凋亡相关蛋白激酶与Caspase家族的级联反应，最终导致细胞凋亡。Fenton反应增强后，ROS基团可氧化DNA碱基。通过脱氧核糖的C8位点上的脱氢作用氧化DNA，使鸟嘌呤氧化成为8-oxo-dG；胸腺嘧啶氧化生成5-羟甲基尿嘧啶。
3.2吡啶甲酸铬酶促分解途径
在胰岛素依赖性细胞中，Apo-LMWCr从吡啶甲酸铬复合体中对铬进行吸附，使吡啶甲酸脱离复合物，游离于胞内，从而造成细胞毒性。在体内吡啶甲酸是色氨酸的代谢产物，它的产生可以诱导一氧化氮合酶表达，导致氮自由基产生，进而引发细胞凋亡。吡啶甲酸还可改变细胞膜的流动性，并能阻止细胞周期（S期）循环。毒理学试验表明：吡啶甲酸在胞内可以螯合其他金属离子发生Fenton反应生成活性氧自由基，并且发现在磷酸盐缓冲液中，吡啶甲酸能增强Cr(pic)3的类Fenton反应。Stearns(2002)研究发现：1mM（120倍适宜量）的吡啶甲酸铬处理组48h后发现细胞存活率为（68±16）%，而吡啶甲酸组仅为27%；但是发现该浓度的吡啶甲酸并不存在致突变性。Manygoats(2002)等对CHO细胞研究发现：吡啶甲酸铬添加量为1mM时，48h后发现37%的细胞发生凋亡，当量的吡啶甲酸产生的细胞毒性比吡啶甲酸铬更强，1.5mM（180倍适宜量）的吡啶甲酸处理组的细胞成活率仅有49%，51%的细胞发生凋亡，71%的线粒体受损。另有研究发现：3mM浓度的吡啶甲酸24h后发现线粒体损伤，5－10mM的吡啶甲酸12－24h后细胞发生凋亡（Ogata等，1998）。可见在细胞毒性上，吡啶甲酸强于吡啶甲酸铬。
在微粒体中吡啶甲酸铬可分解并发生醯胺化、甲基化反应。将人微粒体与吡啶甲酸铬共同孵育1h和3h后，分析得出66%的吡啶甲酸铬被代谢，通过高压液相色谱分析两时间点的结果没有差异。为了验证结果，采用鸡肝细胞体外培养实验后发现，吡啶甲酸铬全部被代谢，三价铬离子脱离。三价铬离子的分离可能会对DNA结构与DNA复制过程造成负面影响，从而阻止细胞的生长增殖，其可能机理如下：Cr（Ⅲ）可与磷酸骨架（Tsapakos等，1983）、鸟嘌呤、染色体组蛋白（H2AX）（Miller等，1989）、染色体结构维持蛋白（SMC）结合（Timothy，2004），从而影响DNA的复制进程。还可与DNA复制所需的酶类结合，如拓扑异构酶的结合，使DNA松弛活性降低，DNA双链不能完全松弛，导致复制终止；与DNA聚合酶（Tkeshelashvili，1980）、RNA聚合酶（Okada等，1981），翻译延长因子复合体（Wang等，1997）的结合，导致复制、转录、翻译过程受阻。
DNA内链交联（ICL）作为DNA加合损伤的另一方式，占DNA-Cr加合物的10%左右，也可阻止DNA的复制。已有研究报道：ICL可以与鸟嘌呤上的N-7残基（Bauer等，1997），以及与磷酸骨架一定程度的结合，从而物理性地阻止模板DNA的复制（Bridgewater等，1994）。在细胞水平上表现为细胞周期循环中断，甚至导致细胞凋亡、程序性死亡。另有资料显示：Cr-DNA加合物诱导的单碱基的改变通常导致G/C→A/T的转变与G/C→T/A的颠换，同时发现，与铬螯合的配体差异，可导致碱基替代频率发生变化（Quievryn等,2003；Zhitkovich等，2001）。
4、结语
适宜量吡啶甲酸铬添加对机体代谢有着积极作用，当添加量远高于生理剂量时有可能产生细胞毒性和DNA毒性。在体内研究吡啶甲酸铬的安全性上，除静脉注射途径外，未见毒性报道。在体外研究上，超量添加吡啶甲酸铬（>0.6mM）时可能出现细胞毒性和DNA毒性。其毒性作用与其代谢途径密切相关，但作用机理尚不完全清楚，有待于进一步研究探索。
