热应激建鲤饲料中吡啶甲酸铬的适宜添加量
王晶晶刘文斌*徐维娜王莹张微微
(南京农业大学动物科技学院，江苏省水产动物营养重点实验室，南京210095)*通讯作者:刘文斌，教授，博士生导师，E-mail:wbliu@njau.edu.cn摘要:本研究旨在探讨热应激建鲤(Cyprinuscarpiovar．Jian)饲料中吡啶羧酸铬的适宜添加量。试验选取初始均重为(32.88±0.17)g的建鲤360尾，随机分为6组(每组4个重复，每个重复15尾鱼)，分别投喂在基础饲料中添加不同水平吡啶羧酸铬的试验饲料，各组饲料Cr3+理论添加量分别为0、300、600、900、1200和1500μg/kg。试验在室内可控温循环流水养殖系统中进行，驯化期10d(26℃)，正试期60d(“常温—高温—常温”应激模式:20d，26℃;20d，31℃;20d，26℃)。结果表明:1)饲料中添加600和900μg/kg吡啶羧酸铬(以Cr3+计，下同)可显著提高建鲤的增重率和蛋白质效率，降低饲料系数(P＜0．05)。与对照组相比，当添加量达到1500μg/kg时，增重率下降3．4%(P＞0．05)。随着饲料中吡啶羧酸铬添加量的升高，建鲤肝体比呈上升趋势，900、1200和1500μg/kg添加组肝体比显著高于对照组(P＜0．05)。2)饲料中吡啶羧酸铬的添加量对建鲤肌肉粗脂肪、灰分和水分含量的影响不显著(P＞0．05)，对肝胰脏粗脂肪含量也无显著影响(P＞0．05)，但300和600μg/kg添加组肌肉和肝胰脏粗蛋白质含量较对照组显著升高(P＜0．05)。3)饲料中添加600μg/kg吡啶羧酸铬可显著提高建鲤血清中白蛋白含量(P＜0．05)，添加1500μg/kg吡啶羧酸铬可显著降低血清总蛋白和白蛋白含量(P＜0．05)，添加600、900、1200和1500μg/kg吡啶羧酸铬可显著降低血清中胆固醇含量(P＜0．05)，添加900、1200、1500μg/kg吡啶羧酸铬可显著降低血清中甘油三酯含量(P＜0．05)。综上所述，在饲料中添加600μg/kg吡啶羧酸铬(饲料中Cr3+实际含量为912．94μg/kg)有较好的抗热应激效果，可促进热应激建鲤生长并提高其肌肉粗蛋白质含量。
关键词：吡啶羧酸铬、热应激;建鲤、适宜添加量
中图分类号：S963
文献标识码：A
文章编号：1006-267X(2011)07-1209-08
在水产动物的整个生命过程当中，环境温度是最重要的外界因素之一，影响着水生动物的生存、生长和繁殖，鱼类在长期进化过程中都有其适宜的环境温度。鲤鱼是温水性鱼类，其适宜生长的水温为22～28℃，温度过高或过低都会对鱼类产生应激。Hans［1］认为应激是具有适应意义的生理反应，目的是维持内稳态;如果机体不能适应所受的应激，内稳态就会被破坏，从而导致机体抵抗力下降、生长缓慢并引起多种病变。铬是动物必需的微量元素，Cr3+作为葡萄糖耐量因子(GTF)的活性成分，与胰岛素之间存在协同作用［2］，共同参与体内三大营养物质的代谢［3］。刘太亮等［4］研究报道，饲料中添加吡啶甲酸铬能提高草鱼对葡萄糖的耐受量，促进草鱼生长。此外，还有研究表明，铬可以提高动物机体抗应激能力［5］;在饲料中添加适宜水平的铬能够促进鱼类的生长，降低鱼的应激反应，提高鱼的运输成活率和运输后暂养成活率［6］。
关于铬对热应激畜禽营养的调控作用研究已开展较多。张敏红等［7］研究发现，给饲养于高温环境中的肉鸡补充吡啶甲酸铬，能够抑制由高温引起的蛋白质分解过程，缓解热应激;王刚等［8］研究证实，在基础饲粮中添加吡啶羧酸铬能提高热应激肉仔鸡的生产性能，改善胴体品质。目前，有关铬对热应激鱼生长性能和血液生化指标的影响报道较少。夏季水温过高，超过鱼类生长的适宜水温，易引起鱼类热应激，导致鱼类摄食量减少、生长速度减慢、抵抗力下降等。本试验选取吡啶羧酸铬作为热应激调节剂，通过在建鲤基础饲料中添加不同剂量的铬，测定热应激条件下建鲤生长指标、形体指标及血清生化指标，旨在探讨吡啶羧酸铬对建鲤的抗热应激作用，为其在水产养殖中的合理添加和应用提供参考。
1、材料与方法
1．1试验材料
试验用吡啶羧酸铬由武汉神舟化工有限公司生产，饲料级，吡啶羧酸铬含量≥9．9%，Cr3+含量≥1．23%。
试验用建鲤购于中国水产科学院淡水渔业研究中心宜兴养殖基地，体质健壮、规格整齐，均重为(32．88±0．17)g。
1．2试验饲料
根据鲤鱼配合饲料营养标准(SC/T1026—1998)配制基础饲料，在基础饲料中添加不同水平的吡啶羧酸铬，配制成试验饲料。试验饲料中Cr3+的理论添加量分别为0(对照组)、300、600、900、1200和1500μg/kg(实测值分别为308．50、581．52、912．94、1209．56、1533．48、1794．34μg/kg)。
基础饲料组成及营养水平见表1。饲料原料粉碎后过80目筛，采用逐级混合法添加微量组分，充分混匀后用小型制粒机制成颗粒料。制粒温度为45～50℃，粒径为1mm，放置在室温中晾干后保存于4℃冰箱中备用。
1．3试验设计与饲养管理
试验分为6组，每组4个重复，每个重复15尾鱼，在南京农业大学水产动物营养与生态学研究室进行。养殖系统为室内可控温循环流水系统，共24个水族箱，每个水族箱(200L)为1个重复。试验从2010年6月25日开始至2010年9月2日结束，共70d，其中驯化期10d(水温为26℃)，正试期60d。整个试验期采取自然光照(昼夜比为10∶14)，白天的平均光照强度是1250lx。
正试期内试验采用“常温—高温—常温”应激模式，即分为3个阶段，第1阶段20d，水温控制在26℃;第2阶段20d，采用程序升温使循环系统内的水温每天升高1℃，5d后升高至31℃并保持15d;第3阶段20d，采用程序降温使循环系统内的水温每天降低1℃，5d后降低至26℃并保持15d。试验期内，每天投喂试验饲料3次(投喂时间分别为08:30、12:30和16:30)，日投喂量占鱼体重的3%～5%。投喂时记录投喂量，30min后观察并记录摄食情况，然后吸出残饵。每天定时排污，并在09:00和13:00各测1次水温。试验期间保持水体pH7．5～8．0、溶氧＞5．0mg/L、氨氮＜0．4mg/L、亚硝态氮＜0．06mg/L、总氮＜1．5mg/L、总磷＜0．8mg/L，以保证水质优良。
1．4样品采集
正试期结束后，禁食24h，将各水族箱中的鱼用浓度为100mg/L的MS－222麻醉后称重，然后从每箱中随机选取5尾鱼，测定鱼体单体体重、体长后用注射器尾静脉采血。采集的血液置于预先制好的肝素抗凝管中，于4℃下3700r/min离心10min，收集血清，标号后分装于－70℃保存备用。将采血后的鱼首先剖开腹腔，剥离出肝胰脏，称重后放入离心管于－70℃保存备用;然后将腹腔内其他内脏剥离，称空壳重;最后去鳞，取侧线以上的中间部分的背肌，去皮去骨后装袋－70℃保存备用。
1．5指标测定
1.5.1生长指标和形体指标
增重率(WGR，%)=100×(Wt－W0)/W0;
饲料系数(FCR)=F/(Wt－W0);
蛋白质效率(PER，%)=100×(Wt－W0)/(F×P);
肝体比(HSI，%)=100×Wh/Wt;
肥满度(CF，%)=100×Wt/L3t;
脏体比(VSI，%)=100×(Wt－Wv)/Wt。
式中:W0为初始体重(g);Wt为终末体重(g);Wh为肝胰脏重(g);Wv为空壳重(g);t为养殖天数(d);F为平均摄食量(g);P为饲料中粗蛋白质含量(%);Lt为鱼终末体长(cm)。
1.5.2饲料、肌肉、肝胰脏中常规营养成分
饲料和肌肉中常规营养成分采用AOAC(1995)［9］的方法测定，即水分采用105℃烘干法测定;粗蛋白质采用凯氏微量定氮法测定;粗脂肪采用索氏抽提法测定;粗灰分采用550℃灼烧法测定;总能采用氧弹测热仪直接测定。
肝胰脏中粗蛋白质亦采用凯氏微量定氮法测定，粗脂肪则采用Folch等［10］的方法测定，具体测定步骤如下:首先取1．25g鲜组织样，加3．75mL氯仿－甲醇混合液(V氯仿∶V甲醇=1∶2)，漩涡震荡10～15min;然后加入1．25mL氯仿，震荡混合1min，再加入1．25mL蒸馏水，混合震荡1min，3700r/min离心10min，收集底层液相于离心管中;再加入1．88mL氯仿到残渣中，漩涡震荡，3700r/min离心10min，将底层液相溶液与上步收集的底层液相溶液混合，持续通氮气干燥样品后称重。
1.5.3血清生化指标
血清总蛋白、白蛋白、甘油三酯、总胆固醇含量的测定采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，其中总蛋白采用考马斯亮兰法［11］，白蛋白采用溴甲酚绿比色法［12］，甘油三酯采用酶法［13］，总胆固醇采用胆固醇氧化酶－过氧化物酶法［12］。
1．6数据处理
试验数据以平均值±标准误表示，采用SPSS16．0软件对数据进行单因素方差分析(One-wayANOVA)，并用Duncan氏法进行多重比较，差异显著性水平设为P＜0．05。
2、结果
2．1
吡啶羧酸铬添加量对热应激建鲤生长指标的影响经过70d的试验，建鲤的各项生长指标见表2。随着吡啶羧酸铬添加量的升高，建鲤终末体重、增重率和蛋白质效率呈先上升后降低趋势，饲料系数则呈先下降后升高趋势。
与对照组相比，饲料中吡啶羧酸铬添加量为600和900μg/kg(以Cr3+计，下同)时，增重率分别提高了20．12%(P＜0．05)和12．57%(P＜0．05)，当添加量达到1500μg/kg时，增重率下降了3．4%(P＞0．05)。600μg/kg添加组蛋白质效率最高，其次是900μg/kg添加组，上述2组均显著高于对照组和1500μg/kg添加组(P＜0．05)。600μg/kg添加组的饲料系数最低，其次是900μg/kg添加组，再次是300μg/kg添加组，上述3组均显著低于对照组和1500μg/kg添加组(P＜0．05)，但3组间差异不显著(P＞0．05)。
2．2
吡啶羧酸铬添加量对热应激建鲤形体指标的影响由表3可知，饲料中吡啶羧酸铬添加量对建鲤肥满度无显著影响(P＞0．05)。随吡啶羧酸铬添加量的增加，建鲤肝体比呈上升趋势，对照组与300和600μg/kg添加组之间差异不显著(P＞0．05)，但显著低于900、1200和1500μg/kg添加组(P＜0．05)，各添加组之间差异不显著(P＞0．05)。饲料中添加300、600和900μg/kg吡啶羧酸铬对建鲤脏体比无显著影响(P＞0．05)，当添加量大于900μg/kg时，建鲤脏体比较对照组显著下降(P＜0．05)。
2．3
吡啶羧酸铬添加量对热应激建鲤肌肉和肝胰脏中常规营养成分的影响由表4可见，建鲤肌肉中粗脂肪、灰分和水分含量不受吡啶甲酸铬添加量的影响，各组间差异均不显著(P＞0．05)。饲料中添加300和600μg/kg吡啶羧酸铬显著提高了肌肉中粗蛋白质含量(P＜0．05)，添加量为900、1200和1500μg/kg的各组肌肉中粗蛋白质含量高于对照组，但差异不显著(P＞0．05)。建鲤肝胰脏中粗脂肪含量也不受吡啶羧酸铬添加量的影响，各组间差异不显著(P＞0．05)。饲料中吡啶羧酸铬添加量为300和600μg/kg时，建鲤肝胰脏中粗蛋白质含量较对照组分别提高了10．84%(P＜0．05)和10．66%(P＜0．05)，添加量为900、1200和1500μg/kg的各组肝胰脏中粗蛋白质含量高于对照组，但差异不显著(P＞0．05)。
2．4
吡啶羧酸铬添加量对热应激建鲤血清生化指标的影响由表5可知，吡啶羧酸铬的添加量对建鲤血清总蛋白和白蛋白含量产生了影响，其均随吡啶羧酸铬添加量的升高先上升后下降。600μg/kg添加组的血清总蛋白含量最高，较对照组升高了4．37%(P＞0．05)，1500μg/kg添加组的血清总蛋白含量最低，显著低于对照组和300、600、900μg/kg添加组(P＜0．05)。600μg/kg添加组的血清白蛋白含量最高，显著高于对照组和900、1200和1500μg/kg添加组(P＜0．05)，1500μg/kg添加组的血清白蛋白含量最低，显著低于其他各组(P＜0．05)。建鲤血清胆固醇和甘油三酯含量均随吡啶羧酸铬添加量的升高而降低。1200μg/kg添加组的血清胆固醇含量最低，其次是1500μg/kg添加组，上述2组均显著低于其他各组(P＜0．05);900μg/kg添加组的血清胆固醇含量较对照组和300μg/kg添加组分别下降了12．4%(P＜0．05)和8．37%(P＜0．05);600μg/kg添加组的血清胆固醇含量与300μg/kg添加组相比差异不显著(P＞0．05)，但显著低于对照组(P＜0．05)。饲料中添加1500μg/kg吡啶羧酸铬能显著降低建鲤血清甘油三酯的含量(P＜0．05)，900和1200μg/kg添加组的血清甘油三酯含量均显著低于对照组和300μg/kg添加组(P＜0．05)，600μg/kg添加组的血清甘油三酯含量与对照组以及300、900、1200μg/kg添加组相比差异均不显著(P＞0．05)。
3、讨论
3．1吡啶甲酸铬对热应激建鲤生长性能的影响
应激能引起机体额外能量需求，这种能量需求要通过机体动员能源物质来满足，因此，在应激状态下用于生长和维持健康的物质和能量减少，导致鱼类生长减缓、免疫力下降、饲料利用率下降。研究表明，当动物遭受应激时糖代谢加强，组织中铬被动员参与反应而排出体外，动物需要及时从饲粮中补充铬，以减少机体铬不足带来的危害［14］;在草鱼饲料中添加吡啶甲酸铬能促进草鱼生长，提高糖的耐受量［4］;在团头鲂基础饲料中添加600μg/kg吡啶羧酸铬，可获得较好的生长性能，同时能提高运输成活率和运输后暂养成活率，增强团头鲂的抗应激能力［5］。本试验结果表明，在饲料中添加600μg/kg的吡啶羧酸铬能显著提高热应激建鲤的增重率、特定生长率和蛋白质效率，降低饲料系数，与上述报道基本一致。此外，本研究还发现，饲料中添加低剂量吡啶羧酸铬能提高建鲤的增重率和特定生长率，促进建鲤生长，但是当添加量达到1500μg/kg时，与对照组相比，增重率和特定生长率降低，饲料系数升高。蔺玉华等［15］的研究证实，饲料中铬添加浓度过高会导致鱼出现负生长，引起毒害作用，与上述结果一致。这是因为长期添加高剂量的吡啶羧酸铬，会突破动物机体铬的储存和调节能力，导致体内铬含量急剧上升，干扰了其他营养成分的吸收和利用，不仅会降低动物的生产性能，还可能引起细胞毒性和DNA毒性。
3．2
吡啶羧酸铬对热应激建鲤形体指标及组织营养成分的影响形体指标能反映鱼体的健康状况、营养水平等。对于相同规格的鲤鱼，肥满度升高表示鲤鱼体型好、增重快。肝胰脏是鱼类中间代谢的重要器官，同时也是鱼类重要的营养储存器官，鱼类的肝体比是对长期和短期营养方式都很敏感的指标，随着营养发生变动肝脏重量也会发生明显的变化［16］。高温使机体能量供应不足而导致机体营养不良，进而引起鱼类生理机能的紊乱。本试验结果表明，当吡啶羧酸铬添加量低于900μg/kg时，各添加组的肥满度和肝体比与对照组相比差异不显著;当添加量超过900μg/kg时，鱼体肥满度有下降趋势，肝体比显著增加，脏体比显著下降。上述结果说明，吡啶羧酸铬添加量低于900μg/kg时，能改善热应激建鲤的营养状况，而吡啶羧酸铬添加剂量过高导致肝脏明显偏大。结合生长指标得出，建鲤长期摄食含高浓度吡啶羧酸铬的饲料，不仅生长性能下降，还对鱼类肝脏造成了损害。
铬能够促进氨基酸进入细胞，提高蛋白质的合成能力，还参与核酸代谢、维持核酸的稳定和完整。这是由于铬可通过增强胰岛素功能来促进蛋白质的合成，起到了类似于营养再分配剂的“定向沉淀”作用，通过改变机体养分的流向，使营养物质趋向肌肉而远离脂肪［17］。Ward等［18］研究发现，在肉鸡饲粮中添加200μg/kg吡啶甲酸铬可增加胴体蛋白质含量，减少脂肪含量。潘庆等［19］认为，在奥尼罗非鱼饲料中添加烟酸铬，对肌肉和肝胰脏营养成分无显著影响。本研究结果发现，饲料中添加不同水平的吡啶甲酸铬对热应激建鲤背部肌肉水分、灰分、粗脂肪含量影响不显著，但可显著提高粗蛋白质含量。此外，吡啶羧酸铬不仅能提高肌肉中粗蛋白质含量，还能提高肝胰脏中粗蛋白质含量，说明饲料中添加的铬增强了肝脏合成蛋白质的能力。本研究结果与潘庆等［19］的研究结果有一定的差异，造成这可能是由试验动物以及选用的铬源不同造成的。
3．3
吡啶羧酸铬对热应激建鲤血清生化指标的影响桂丹等［20］的研究表明，水温在2h内由常温(25℃)升至高温(31℃)，并维持24h，热应激对异育银鲫造成了损伤。建鲤属于温水性鱼类，其适宜生长水温为22～28℃，本研究水温由常温(26℃)升至高温(31℃)，并维持高温15d，建鲤发生了热应激。
血清总蛋白及其中的白蛋白能够反映动物的营养状况，良好的营养状况可使血清中蛋白质维持在一个较高的水平。Amoikon等［21］认为，补充有机铬可增强氨基酸合成蛋白质的能力，从而降低氨基酸代谢成尿酸随尿排出体外的数量，提高血清总蛋白含量。蔺玉华等［15］研究表明，在饲料中添加0．5mg/kg六水氯化铬，鲤的血清总蛋白含量虽然降低，但仍在正常范围之内，降低的原因可能是由于铬促使氨基酸向组织蛋白转化的缘故，因此其相对生长率高于对照组。本研究发现，在饲料中添加适量吡啶羧酸铬能提高血清中总蛋白含量，其中600μg/kg添加组比对照组提高了4．4%，当吡啶甲酸铬添加量达到1500μg/kg时，血清中总蛋白含量显著低于对照组;随着饲料中吡啶羧酸铬添加量的升高，建鲤血清中白蛋白含量先升高后降低，添加量为600μg/kg时血清白蛋白含量最高。肝脏是血液蛋白质合成的主要器官，补充铬能促进肝脏中甘氨酸、丝氨酸、蛋氨酸的利用，增强蛋白质合成，铬添加量过高时，可引起肝脏病变或中毒，引起肝脏合成蛋白功能减弱，而使血清总蛋白含量降低。本试验中，600μg/kg添加组的血清总蛋白和白蛋白含量都是最高的，表明此添加剂量的吡啶羧酸铬使建鲤蛋白质合成代谢能力加强，肌肉沉积增加，由高温引起的蛋白质分解过程受到了抑制，起到了缓解高温应激的作用。
Cr3+参与动物机体胆固醇的平衡调节，影响胆固醇在动物肝脏中的合成与清除，能够促进脂肪的重分配，提高血液中高密度脂蛋白的含量，降低血清中胆固醇水平，同时，铬还能促进脂肪组织的水解，生成的脂肪酸通过β－氧化途径氧化供能，为其他组织的正常代谢或生理功能的发挥提供所需的能量。研究发现，鲤鱼饲料中添加0．5mg/kg的氯化铬，血清甘油三酯含量显著降低［16］;蛋鸡饲料中添加吡啶甲酸铬，血清总胆固醇含量显著降低［22］。本研究结果和上述结果相一致，即在饲料中添加吡啶羧酸铬能降低血清中胆固醇和甘油三酯的含量。
4、结论
本试验条件下，在饲料中添加600μg/kg吡啶甲酸铬(饲料中Cr3+实际含量为912．94μg/kg)有较好的抗热应激效果，可促进热应激建鲤生长并提高其肌肉中粗蛋白质含量。
参考文献：22篇（略）
【本文发表于《动物营养学报》，2011，23(7)：1209-1216】
